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關於細菌超聲破碎的一些經驗總結

釋出時間╃│✘•✘:2022-09-05      點選次數╃│✘•✘:74

細菌工程菌胞內表達主要分為兩種形式◕☁▩,一種是在強啟動子條件下的高效表達◕☁▩,由於蛋白的過度表達◕☁▩,使蛋白不能及時有效摺疊而發生無規則捲曲◕☁▩,以固體顆粒的形式堆積於胞間質中◕☁▩,這就是所說的包涵體◕☁▩,另外一種是間質內的可溶性表達◕☁▩,即可以發生正常摺疊◕☁▩,具有生物活性▩•│◕☁。一般情況下◕☁▩,細菌只要被正常破壁就可以透過離心的形式將包涵體和可溶性表達的蛋白分離開▩•│◕☁。

超聲破碎的條件一般是300w◕☁▩,10s/10s◕☁▩,20分鐘◕☁▩,具體條件可根據自身情況而定▩•│◕☁。

超聲前菌體的準備╃│✘•✘:菌液離心後◕☁▩,先用PBS將菌沉澱洗2-3遍◕☁▩,然後按原菌液體積的1/5-1/10加入裂解液重懸菌體◕☁▩,裂解液的成分╃│✘•✘:50mMTris-HCl, pH8.0, 2mM EDTA◕☁▩,100mM NaCl◕☁▩,加溶菌酶至100ug/ml◕☁▩,0.1%Triton X-100▩•│◕☁。切記冰浴超聲│☁↟!

如何判斷是否超聲完全╃│✘•✘:根據網友的經驗◕☁▩,一般有以下幾個方面╃│✘•✘:

1◕☁▩,外觀判斷╃│✘•✘:超聲前菌懸液是渾濁的◕☁▩,超聲完全後變的透明•◕✘✘、清澈▩•│◕☁。

2◕☁▩,液體的粘滯性╃│✘•✘:超聲後菌液從槍頭滴下不粘連▩•│◕☁。

3◕☁▩,高速離心╃│✘•✘:有用高速離心檢測超聲破碎程度的(一般用6,000 g 10 min, 比一般離心收集菌體的轉速高一點)▩•│◕☁。 沉澱是未破碎或破碎不完全的菌體▩•│◕☁。

4◕☁▩,染色╃│✘•✘:破碎後的菌液塗片◕☁▩,革蘭氏結晶紫溶液染色0.5分鐘◕☁▩,鏡檢▩•│◕☁。

超聲後加入核酸酶消除核酸對蛋白的汙染▩•│◕☁。

一些需要注意的問題╃│✘•✘:

1◕☁▩,蛋白以包涵體形式表達◕☁▩,追求的是高破碎率◕☁▩,要求細胞碎片很小◕☁▩,而另一種蛋白是可溶形式表達◕☁▩,所以細胞碎片不能很小◕☁▩,兩種情況要求不同但目的相同◕☁▩,都是便於後期的固液分離▩•│◕☁。

2◕☁▩,如果超聲時出現黑色沉澱◕☁▩,說明超聲功率太強▩•│◕☁。

3◕☁▩,超聲時間太長•◕✘✘、功率太高對蛋白活性肯定有影響▩•│◕☁。

4◕☁▩,儘量防止泡沫的產生▩•│◕☁。


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